Как использовать ультразвук для разрушения клеток и экстракции ДНК/РНК?

Как использовать ультразвук для разрушения клеток и извлечения ДНК/РНК?

Ультразвук является эффективной и широко используемой технологией в клеточном разрушении и экстракции нуклеиновой кислоты (ДНК / РНК).Его основной принцип заключается в использовании эффекта кавитации и механических вибраций для разрушения структуры клеток и высвобождения внутренних веществНиже приведено объяснение конкретного механизма, процесса подачи заявки и основных мер предосторожности:

I. Принцип и процесс ультразвукового исследования для разрушения клеток
Ядро клеточного разрушения заключается в разрушении клеточной мембраны (животные клетки) или клеточной стенки + клеточной мембраны (растения, бактерии, грибы и т. д.) для высвобождения внутриклеточных веществ (таких как нуклеиновые кислоты,белкиУльтразвук достигает этого процесса с помощью следующих механизмов:
1Основной принцип: эффект кавитации
Ультразвук - это высокочастотная механическая волна с частотой выше 20 кГц. Когда ультразвуковой зонд (усилитель ультразвукового разрушителя) вставляется в жидкий образец, содержащий клетки,создается высокочастотная вибрация (обычно 15-50 кГц), что вызывает кавитацию в жидкой среде:

Высокочастотные вибрации вызывают образование большого количества крошечных пузырей (кавитационных пузырей) в жидкости.и наконец, разорвался (совершился).
Когда пузыри лопнут, будет высвобождена огромная мгновенная энергия (местная высокая температура, высокое давление и сильные ударные волны),и сила удара, произведенная будет напрямую разорвать структуру мембраны клетки (клеточная мембрана, клеточная стенка) для достижения клеточной фрагментации.
2Вспомогательный эффект: механические вибрации и сила сдвига
Высокочастотные механические вибрации ультразвука также напрямую генерируют силу сдвига и силу трения на клетках, что способствует разрушению структуры клетки,особенно для клеток с толстыми клеточными стенками (например, грибов и растительных клеток).
3Процесс фрагментации (например, экспериментальная операция)
Положите подлежащую обработке суспензию клеток (такую как жидкость для бактериальной культуры, гомогенат тканей и т. д.) в центрифугу или стакан, введите ультразвуковой зонд (горн),и зонд должен быть погружен в жидкость, но не в контакте с стенкой контейнера.

Включите ультразвуковой прибор и установите параметры (мощность, время и т. д.): высокочастотные вибрации создают кавитационные пузыри в жидкости,и ударная сила, создаваемая разрывом пузырей, непосредственно разрушает структуру клетки и высвобождает внутриклеточные вещества (включая нуклеиновые кислоты), белки, метаболиты и т.д.).
2Специфическое применение ультразвука при экстракции ДНК/РНК
Основные этапы экстракции ДНК/РНК включают: разрушение клеток для высвобождения нуклеиновых кислот → удаление примесей (белок, липидов, полисахаридов и т. д.) → очищение нуклеиновых кислот.Роль ультразвука в основном сосредоточена на первом этапе - эффективном разрушении клеток и высвобождении нуклеиновых кислотКонкретные сценарии применения и преимущества следующие:
1. Подходящие типы образцов
Ультразвук подходит для экстракции нуклеиновой кислоты из различных образцов, в том числе:

Ткань животного происхождения (например, печень, мышцы): сначала ее нужно разрезать на мелкие кусочки, ультразвук может быстро разрушить клетки и высвободить нуклеиновые кислоты;
Бактерии/ грибы: клеточные стенки относительно твердые, традиционные методы (такие как лечение лизозимом) неэффективны, а ультразвук может разрушать клеточные стенки благодаря сильному кавитационному эффекту;
Культивируемые клетки (прицепные или суспензионные клетки): прямая суспензия, а затем ультразвуковое исследование, не требует сложной предварительной обработки;
Растная ткань: содержит целлюлозу и пектин, ультразвук может помочь в разрушении клеточных стен и высвобождении содержимого клеток.
2Ключевые параметры в работе (влияющие на качество нуклеиновых кислот)
Ультразвуковая обработка требует строгого контроля параметров, чтобы избежать деградации нуклеиновой кислоты или чрезмерной фрагментации (влияет на последующие эксперименты, такие как ПЦР, секвенирование и т. д.):

Сила: обычно 50 - 300 Вт (корректируется в зависимости от типа образца, например, бактериям требуется большая мощность).и слишком низкая мощность приведет к недостаточной фрагментации.
Рабочее время/интервал времени: Use "pulse" treatment (such as working 30 seconds + intermission 30 seconds) to avoid continuous ultrasonic heat generation leading to nucleic acid denaturation (DNA/RNA is easily degraded at high temperature).
Общее время обработки: зависит от образца (например, 1-3 минуты для клеток животных и 3-5 минут для бактерий).
Управление температурой: ледяная ванна на протяжении всего процесса (пробы помещаются на лед), поскольку ультразвуковой процесс будет генерировать тепло (эффект кавитации, сопровождающийся местной высокой температурой),низкая температура может ингибировать активность нуклеазы и защищать стабильность нуклеиновых кислот.

3Преимущества и меры предосторожности
Преимущества
Высокая эффективность: быстрее, чем традиционные методы (например, измельчение, повторное замораживание и оттаивание, ферментативный гидролиз) (обычно завершается в течение нескольких минут) и более глубокое нарушение;
Универсальность: применима к различным типам образцов (животные, растения, микроорганизмы и т.д.);
Простая в эксплуатации: не требуются сложные реагенты, требуются только ультразвуковые приборы и базовое оборудование для центрифугирования.
Предупреждения
 Избегайте пузырей: если в образце большое количество пузырей, эффективность эффекта кавитации будет снижена, и зонд может перегреться.Убедитесь, что зонд полностью погружен в жидкость (уровень жидкости составляет около 1-2 см);
ингибирование нуклеазы: после срыва необходимо вовремя добавить раствор лиза (включая EDTA, моющее средство и т. д.) для ингибирования внутриклеточных нуклеаз (например, RNase, которая легко разлагает РНК);
Объем образца: объем обработки не должен быть слишком большим (обычно ≤ 5 мл), иначе распределение ультразвуковой энергии будет неравномерным, а эффект нарушения будет сильно варьироваться.

Резюме
Ультразвук эффективно разрушает клетки с помощью кавитационного эффекта и механической вибрации, обеспечивая ключевой "этап высвобождения" для экстракции ДНК / РНК.время и температура для полного разрушения клеток при максимальной защите целостности нуклеиновых кислотЭта технология широко используется на этапе предварительной обработки молекулярных биологических экспериментов (таких как клонирование генов, qPCR, анализ транскриптома и т.д.).) и является важным инструментом для экстракции нуклеиновых кислот..